| Resumo: |
Dans le cadre de ce travail, l'étude du système neuroendocrine de la moule Mytilus edulis a été envisagée sous plusieurs aspects qui définissent les quatre grandes parties de la thèse. Dans une première partie est décrit le travail de préparation et de caractérisation d'anticorps monoclonaux (AcMc) spécifiques de ganglions cérébroïdes (GC) de Mytilus edulis. Le développement de techniques de préparation d'AcMc dirigés contre des antigènes non purifiés a en effet permis de produire un ensemble de réactifs de type AcMc dirigés contre différents antigènes issus d'un broyat de GC de moule. La spécificité de ces AcMc a été étudiée en microscopie optique puis électronique selon des techniques immunocytochimiques (immunopéroxydase indirecte et immunogold). La recherche de neuropeptides circulant dans l'hémolymphe, soit sous forme libre, soit fixés sur des hémocytes a été envisagée en criblant les AcMc en immunonuorescence ou par immunodosage enzymatique (ELISA). L'ELISA a été mis au point sur un extrait de ganglions cérébroïdes de moule puis appliqué sur de l'hémolymphe filtrée afin d'identifier les anticorps spécifiques d'épitope libres; les anticorps marqueurs d'épitopes présents sur les hémocytes ont été identifiés en immunonuorescence sur primocultures d'hémocytes. La possibilité d'un effet direct des neurosécrétions sur les hémocytes a été prise en compte: un test biologique in vitro permettant d'évaluer les capacités phagocytaires des hémocytes est disponible chez la moule; il consiste à mesurer la chimioluminescence émise par une suspension hémocytaire en présence d'un extrait de GC et permet d'aborder les interactions entre les systèmes neuroendocrine et immunitaire. Les tous premiers éléments de cette étude ont mis en évidence un net effet inhibiteur des ganglions sur l'activité phagocytaire des hémocytes. Les résultats de cette caractérisation des spécificités des différents AcMc ont permis de sélectionner les anticorps les plus adaptés à la purification future de neurosécrétions par immunoaffinité. Parmi les anticorps monoclonaux produits et caractérisés, l'un d'entre eux (AcMc 46) présentait un profil en immunoperoxydase sur coupe de ganglions particulièrement intéressant par comparaison aux profils obtenus avec différents anticorps anti-insuline d'autres invertébrés. Or chez les mollusques, les molécules de type insuline sont particulièrement intéressantes puisqu'elles semblent être impliquées dans les mécanismes liés à la croissance. Chez la moule, un biotest actuellement disponible permet de caractériser les facteurs neurohormonaux impliqués dans la croissance en mesurant leur effet sur l'incorporation d'acides aminés marqués dans des cellules de bords de manteaux. Après fractionnement de l'extrait ganglionnaire par HPLC en fonction du poids moléculaire, deux fractions ont montré un fort effet activateur de l'incorporation d'acides aminés. La première correspondait à des molécules de PM égal à 1000 Da; la seconde correspondait à des molécules éluées en même temps que l'insuline. Par ailleurs, cet effet a été inhibé lorsque l'extrait ganglionnaire était mis en présence de l'AcMc 46. La recherche de gènes correspondant à des protéines de type insuline a fait l'objet de la quatrième partie de cette thèse. Cette recherche a été abordée selon deux techniques fondées sur l'existence de zones d'homologies entre les gènes identifiés chez plusieurs espèces d'invertébrés. La première de ces techniques consiste à amplificier in vitro des régions de ces gènes. Les séquences amplifiées par PCR sont ensuite clonées et séquencées puis comparées aux séquences connues. Cette technique permet d'acquérir rapidement des informations précises, mais reste aléatoire quant aux résultats obtenus. Aussi, une deuxième technique, plus longue à mettre en oeuvre mais généralement moins aléatoire a-t-elle été utilisée: une banque d'ADNc de ganglions de moules a été construite puis criblée avec des oligonucléotides consensus dégénérés préparés à partir de séquences connues apparentées à l'insuline. Cette banque, désormais disponible, permettra dans l'avenir, d'identifier des transcrits codant pour des précurseurs impliqués dans le contrôle neuroendocrine des processus physiologiques de Mytilus edulis.
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